1.3、疏水作用层析

1. 疏水层析的原理：

疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。由于蛋白质是一类有序三维结构的活性大分子，但其空间排列很容易受到外界环境的影响，极易从有序的结构变成无序结构。当立体结构发生变化时，常常失去原有的活性，即蛋白质的失活。使用适度疏水性的分离介质，在含盐的水溶液体系中，借助于分离介质与蛋白质分子之间的疏水作用达到吸附活性蛋白分子的目的，这种层析技术称为疏水作用层析。

蛋白质的一级结构中有很多非极性氨基酸，这些氨基酸在三级结构上由于疏水相互作用会被尽量包在分子内部，但是仍不可避免地有一些非极性侧链暴露在表面，这些非极性的表面是它和疏水层析介质作用的结合部位。因为蛋白质分子的疏水性不同，它们和疏水层析介质的作用力强弱也不同，所以非极性表面的大小和含量决定了蛋白质分子的疏水性强弱。疏水层析就是利用各种蛋白质分子和疏水功能基团之间作用力的差异对蛋白质进行分离、纯化的一种技术。

蛋白质可以看成是一种有亲水性外壳包裹着疏水性核心的四级结构的复杂体系。蛋白质表面存在一些非极性的疏水基团，这些基团多为非极性的氨基酸残基。由于各种基团疏水性的差别、疏水基团暴露数量的不同、疏水区与亲水区在数量、大小和分布的不同等因素，使各种蛋白质之间存在较大的差异，同时，对于同一种蛋白质在不同的溶液中，使疏水基团暴露的程度也呈现出一定的差异。由于这种差异，致使各种蛋白质分子与同一种分离介质疏水基团的相互作用不同，吸附能力不同，可以达到分离的目的。

如果在水溶液中加入中性盐，使溶液处于高盐浓度时，可以破坏蛋白质分子表面水分子的有序排列，使大分子与分离介质的功能基团之间产生疏水作用。同时，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，增加了大分子的疏水性，增强了蛋白质分子与分离介质功能基团之间的疏水作用，相互结合力增强。在疏水作用的驱动下，蛋白质分子从溶液中被吸附到分离介质上，改变了蛋白质分子在水相与分离介质相中的分配系数，达到了吸附的目的。

在目标产物被分离介质吸附后，使用低盐含量的溶液通过层析柱，降低了蛋白大分子与分离介质之间的疏水作用，使目标产品脱离分离介质，扩散到溶液中，达到洗脱的目的。各种大分子的疏水性强度不同，与分离介质之间的疏水作用不同，各有用物质根据疏水性的强弱将依次被洗脱，出现不同的洗脱峰，达到多种物质分离的目的。

2. 疏水层析的优点：

与蛋白质作用条件温和。疏水作用层析只需改变溶液中的盐含量，就可以进行吸附或洗脱。操作条件温和，蛋白质分子结构无明显变化，蛋白质分子活性回收率高。尤其适用于对环境比较敏感，分子量较大的蛋白质的分离。

选择性强。在特定盐浓度下，疏水作用层析介质对蛋白质的吸附选择性较强，对于疏水性不同的蛋白，只要改变洗脱盐的浓度，就可以对蛋白实现较好的分离。

具有优良的物理、化学稳定性。分离介质结构稳定，可以有较长的使用寿命，并可长期反复使用。

无环境污染。疏水作用层析在操作过程中，只使用盐的水溶液作流动相，除介质的再生外很少使用有机溶剂，因此，不会对环境造成危害，易于工业规模生产。

易于和其他层析技术联合使用。疏水作用层析介质易于和其他层析技术联合使用，可减少操作步骤，节约生产成本。适用于含盐量较高，或离子强度较大的溶液中进行蛋白质的吸附分离。